干細胞衍生的腦類器官是模仿胚胎大腦結(jié)構(gòu)人工培育的微型器官。它們由多種神經(jīng)細胞類型組成，具有3D細胞層組織，表現(xiàn)出局部場電位。為了監(jiān)測厚球形樣本的類器官內(nèi)電活動，此項研究開發(fā)了能夠穿透腦類器官內(nèi)部區(qū)域的長突起微電極陣列，以測量類器官內(nèi)神經(jīng)元的局部電位。研究者們開發(fā)出了一種新的微加工工藝，可以在垂直上升的超過兩百微米的橫梁頂端制造突出的懸臂微電極陣列。這些細長的橫梁深深插入類器官內(nèi)，可以記錄埋藏在類器官內(nèi)的神經(jīng)元的局部場電位。這種新型裝置將為更詳細地研究神經(jīng)功能提供寶貴的工具。

研究思路

Methods開發(fā)一種新的微加工工藝，用于制造長的突出式微電極陣列（csMEA），以測量類器官內(nèi)神經(jīng)元的局部電位。為了實現(xiàn)這一目標，研究人員首先設(shè)計了一個新的微加工流程，然后使用該流程制造了突出式微電極陣列。研究人員將突出式微電極陣列應(yīng)用于人類大腦類器官中，以測量神經(jīng)元的電位。最后對實驗結(jié)果進行了分析和討論，探討了該技術(shù)在神經(jīng)科學領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

主要結(jié)果

ResultsMEA設(shè)計研究人員設(shè)計了一種csMEA，該陣列由許多微小的彎曲和尖銳的微電極組成，可以穿透組織并靈敏地記錄局部場電位。為了制造這種陣列，研究人員使用了一種新的微加工技術(shù)，該技術(shù)可以制造出足夠尖銳和細長的微電極，以直接穿透類器官并進行電位測量。此外，研究人員還設(shè)計了一個PDMS環(huán)，用于將類器官固定在突出式微電極陣列上。為了制造這種陣列，研究人員使用了一種復雜的微細加工流程。該流程包括四個層次的掩膜制作，制作過程從清洗玻璃基板開始，然后在基板上蒸發(fā)一層厚度為300μm的鋁膜。使用掩膜制作技術(shù)，將鋁膜刻蝕成所需的形狀。然后使用PDMS制作技術(shù)制作懸臂式結(jié)構(gòu)，并將其與微電極陣列結(jié)合在一起。最后使用化學腐蝕技術(shù)將鋁膜層溶解，從而形成懸臂式結(jié)構(gòu)。

圖1(a)MEA的橫截面示意圖。(b)在傳統(tǒng)平面MEA上放置大腦類器官的示意圖以及類器官插入尖刺微電極的示意圖。(c)功能MEA的照片，顯示PDMS內(nèi)環(huán)和外環(huán)。(d)顯示與實際光刻掩模相對應(yīng)的4個不同層次的MEA布局。(e)植入MEA并用PDMS環(huán)固定的類腦的3D示意圖。

光束釋放

光束釋放是一種微細加工技術(shù)，用于制造懸臂式MEA。該技術(shù)利用了光的能量來釋放懸臂式結(jié)構(gòu)，從而形成微電極陣列。

圖2尖頭電極微細加工原理示意圖（a）。蝕刻完成后，運動的橫梁會放松內(nèi)應(yīng)力并伸直（b）。(c)微光束陣列在光束釋放前后的光學照片。(d)整個陣列的掃描電子顯微鏡圖像，(e)顯示每個光束上活性區(qū)域的光束細節(jié)。光束正確曲率（f）和過度曲率（g）示例。(h)一根懸臂末端活動區(qū)域的細節(jié)。

圖3(上圖）分析機械問題的示意圖和長度不斷增加的松弛懸臂梁的掃描電鏡照片，顯示了圓形變形形狀以及曲率半徑的測量結(jié)果。(下圖）曲率半徑與懸臂厚度的關(guān)系，分析模型（藍線）與測量結(jié)果（紅點）的比較。

機械建模

在計算受到壓力和力矩作用的機械梁和懸臂的變形形狀時，可以使用歐拉-伯努利理論或Timoshenko-Ehrenfest梁理論來建立更精細的模型。接下來評估懸臂深入插入hESC衍生腦類器官的能力。為此，研究者們開發(fā)了具有突出懸臂的相同裝置，為了不影響顯微鏡觀察，沒有使用金屬層，而是使用與浸入式透鏡兼容的薄玻璃。為了進一步了解光束插入類器官的空間情況，對懸臂插入的類器官進行了共聚焦和光片顯微鏡分析。用PLL-FITC標記懸臂，通過在SiO2和Si3N4上附著聚賴氨酸將熒光素粘合到懸臂上，以便用熒光顯微鏡觀察懸臂。3D觀察清楚地表明，橫梁插入了類器官中（圖4d-f）。

用掃描電鏡（SEM）觀察懸臂上被刺穿的類器官。在進行掃描電子顯微鏡分析時，除了固定和干燥外，沒有對類器官進行任何特殊處理。結(jié)果證實了微光束確實穿透了類器官。如圖4b所示，研究首次使用平面MEA對腦類器官進行了電生理學實驗。研究者開發(fā)了穿透性懸臂，以獲得類器官內(nèi)部的電活動。結(jié)果顯示，可以在所有類器官中檢測到自發(fā)信號，每個電極的平均點燃率為每分鐘0.5個尖峰（圖5d）。將刺入的類器官在MEA上培養(yǎng)了17天，再次進行電記錄時，可以看到它們保持了類似的發(fā)射率（圖5d），這表明該過程在很長一段時間內(nèi)都是可靠的。這些結(jié)果表明，將微電極放置在插入腦器質(zhì)性模型內(nèi)部的懸臂上，能夠測量因電活躍細胞的電活動而產(chǎn)生的局部電位，其振幅可達幾百微伏，具有典型的細胞外記錄形狀。

圖4源自hESC的皮質(zhì)類器官及其csMEA植入物的表征。(a)用3毫米PDMS環(huán)固定在懸臂MEA中心的大腦皮質(zhì)類器官的透射光顯微鏡觀察；(b)放置在錐形MEA頂部的大腦皮質(zhì)類器官的透射光顯微鏡觀察。(c)干燥后懸掛在懸臂MEA上的腦類器官的掃描電子顯微鏡。(d)共焦圖像采集：將類器官植入csMEA。(e)懸臂附近細胞的共聚焦成像。(f)類器官脫離csMEA但懸臂仍在其內(nèi)的光片成像。

圖5懸臂微電極顯示類器官內(nèi)部自發(fā)的電活動。(a)對整個csMEA陣列進行的5分鐘電記錄，以及csMEA陣列的代表性照片和示意圖。(b)在植入csMEA 3天和17天后，測量植入csMEA的單個類器官的自發(fā)活動尖峰。(c)用一個電極記錄的類器官植入后24小時和4天的信號軌跡和截圖。隨著時間的推移，記錄到的信號越來越強，可達數(shù)百微伏。(d)植入csMEA 3天和17天的腦類器官細胞的平均發(fā)射率。

總結(jié)

本研究成功制造出了一種新型csMEA和懸臂式MEA，并且對這兩種陣列進行了電位測量和性能測試。研究人員還比較了這兩種陣列的性能，并發(fā)現(xiàn)突出式微電極陣列具有更高的信噪比和更好的空間分辨率，而懸臂式MEA則具有更好的機械穩(wěn)定性和更高的靈敏度。此外，研究人員還使用這兩種陣列對腦類器官進行了電位測量，并成功記錄到了神經(jīng)元的活動信號。這兩種新型的微電極陣列，為神經(jīng)科學研究提供了新的工具。這些陣列具有高精度、高效率和可重復性的優(yōu)點，可以用于記錄神經(jīng)元的活動信號，并研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病機制。此外，本文還介紹了一些新的微細加工技術(shù)，如光束釋放和PDMS環(huán)制作技術(shù)，這些技術(shù)可以用于制造其他類型的微電極陣列和微型傳感器。因此，本文的研究成果對于微電子學和神經(jīng)科學領(lǐng)域的研究具有重要的意義。