2結(jié)果與分析

2.1電極預(yù)處理效果的電化學(xué)表征

由圖2-A可以看出，電位差在80 mV以下，峰電流比值趨近于1。由圖2-B可以看出，在不同掃描速率條件下(25、50、75、100、125、150、200 mV·s-1)，活化后的玻碳電極(GCE)還原峰和氧化峰電流均和掃描速率的平方根呈良好的線性關(guān)系，說明玻碳電極經(jīng)過處理后其氧化還原峰電流僅受擴(kuò)散條件控制，玻碳電極作為裸電極的預(yù)處理效果達(dá)標(biāo)，可以進(jìn)行后續(xù)的組裝研究。

圖2玻碳電極預(yù)處理效果的循環(huán)伏安法表征(A)及預(yù)處理后的玻碳電極的還原峰和氧化峰電流和掃描速率的關(guān)系(B)

2.2電極組裝過程及電化學(xué)表征

由圖3可以看出，在掃描速率為50 mV·s-1，掃描范圍為-0.1~0.6 V的條件下，玻碳電極使用雙核微孔膜組裝后，由于核微孔膜阻礙了電子向電極表面的傳遞，所以峰電流值低于裸電極峰電流值;在兩層膜中間組裝上植物根尖分生組織后峰電流值進(jìn)一步減小，這是由于植物根尖分生組織進(jìn)一步阻礙了電子的傳遞。由圖3峰電流的變化可以看出，該組織傳感器組裝成功。

圖3循環(huán)伏安法對(duì)電極不同階修飾段的表征

2.3電流—時(shí)間測(cè)定法的電位優(yōu)化

將構(gòu)建好的植物根尖分生組織傳感器置于超純水中，采用電流—時(shí)間法，在不同電位下測(cè)試。以加入1×10-6mol·L-1的尿素前后穩(wěn)態(tài)電流差去衡量不同電位對(duì)該傳感器電化學(xué)響應(yīng)效果的影響。由圖4可知，該傳感器在-0.38 V時(shí)電流變化值最大，我們選擇-0.38 V為恒電位進(jìn)行植物根尖分生組織傳感器對(duì)尿素傳感動(dòng)力學(xué)特性的研究。

圖4電位對(duì)生物傳感器響應(yīng)效果的影響

2.4植物根尖分生組織傳感器對(duì)尿素濃度的檢測(cè)范圍

將固定好的植物根尖分生組織傳感器用不同濃度的尿素溶液刺激，濃度從低到高依次測(cè)定，時(shí)間—電流法掃描，掃描電位選擇-0.38 V，靜置10 s左右，使受體和尿素充分結(jié)合后，第100秒電流值為穩(wěn)態(tài)電流，每組實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)試3次，采用的數(shù)據(jù)是經(jīng)儀器軟件平均化后的響應(yīng)電流，以減少誤差。以電流在受體—配基結(jié)合前后電流的變化率△I為縱坐標(biāo)，為方便后續(xù)計(jì)算以配基—尿素濃度C(mol·L-1)的對(duì)數(shù)值lg(C)為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖5，在低濃度范圍內(nèi)，電流變化值呈線性增長(zhǎng)，說明此時(shí)根尖對(duì)尿素的傳感能力遠(yuǎn)大于尿素的量，后一部分呈曲線式緩慢增長(zhǎng)，說明組織對(duì)尿素的傳感能力已接近上限。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖钦业阶钚№憫?yīng)濃度，繼續(xù)增大尿素濃度對(duì)后續(xù)細(xì)分測(cè)試濃度和聯(lián)動(dòng)變構(gòu)常數(shù)的計(jì)算沒有影響。因此，無需繼續(xù)增加尿素濃度。

圖5玉米(A)、辣椒(B)、花椰菜(C)和黃瓜(D)在檢測(cè)范圍內(nèi)的電流變化率

由圖5知，玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜分別在10-9~10-3、10-16~10-6、10-19~10-10和10-20~10-10mol·L-1尿素的濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流的變化率隨著濃度的增加呈現(xiàn)類似酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。

2.5植物根尖分生組織傳感器對(duì)尿素傳感作用的動(dòng)力學(xué)曲線

由圖5對(duì)電流變化率ΔI呈線性變化的濃度范圍做進(jìn)一步的細(xì)分，通過時(shí)間電流法測(cè)定，用Origin 2019軟件分別對(duì)得到的參數(shù)曲線進(jìn)行雙曲線擬合，得出4種植物準(zhǔn)確的受體—配體互作動(dòng)力學(xué)參數(shù)[18]，如圖6。

圖6玉米(A)在10-8~10-4 mol·L-1、辣椒(B)在10-16~10-14mol·L-1、花椰菜(C)在10-19~10-4 mol·L-1和黃瓜(D)在10-20~10-18mol·L-1濃度范圍內(nèi)電流變化率及雙曲線擬合

根據(jù)受體—配體互作動(dòng)力學(xué)方程

上式為以[RL]為變量的一個(gè)雙曲線一元二次方程。當(dāng)[RT]、Kd為固定時(shí)，[RL]隨[LT]的變化而變化，開始上升地很快，以后逐漸趨向于水平，這就是受體—配體互作的飽和曲線。該式說明了受體與配體的結(jié)合具有配體飽和的效應(yīng)，和米氏酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有相似的特征。于是我們可以獲得類似于Km值的重要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)Ka(配體—受體互作所產(chǎn)生的聯(lián)動(dòng)變構(gòu)激活常數(shù))。

從圖6可以看出，在較低濃度下，電流的變化率隨尿素濃度的增加而增加，表明此時(shí)根尖組織上的受體傳感能力遠(yuǎn)高于檢測(cè)溶液中的配體濃度。當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，隨著尿素濃度的持續(xù)增加，電流的變化率基本恒定或變化非常小，表明此時(shí)根尖組織上的受體傳感能力已達(dá)到飽和。上述過程表明，傳感器不僅反映了受體與配體的結(jié)合，還反映了受體與配體結(jié)合后的通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和級(jí)聯(lián)放大導(dǎo)致的電化學(xué)信號(hào)的改變，如離子通道的開啟或關(guān)閉。