三、材料與方法

01.外接觸/互連圖案化

采用特定的硅襯底用丙酮和異丙醇超聲清洗。硅/二氧化硅襯底經(jīng)處理后，使用光刻技術(shù)對鉑接觸和互連進(jìn)行圖案化。包括旋涂材料、烘烤、紫外線曝光、蒸發(fā)金屬、剝離以及沖洗等步驟。

02.3DFG合成

通過等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積（PECVD）工藝合成3DFG。包括升溫、穩(wěn)定溫度、產(chǎn)生等離子體等步驟，并在不同條件下進(jìn)行合成和冷卻。

03.3DFG微電極圖案化

3DFG微電極的圖案化按照先前文獻(xiàn)所述的方法獲得。包括沉積二氧化硅薄膜、烘烤和處理、制作鉻硬掩模、刻蝕二氧化硅和3DFG、去除掩模和薄膜、處理電極以及鈍化等步驟。對3DFG電極進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）成像，獲取了高分辨率圖像。固定細(xì)胞的SEM成像通過特定方式進(jìn)行。細(xì)胞在特定條件下固定、染色并嵌入樹脂中。

04.拉曼光譜學(xué)

使用特定儀器和條件進(jìn)行，在多個點(diǎn)采集了拉曼光譜。紫外可見光譜法3DFG是按照上述方案在1.5厘米×1.5厘米的熔融石英基底上合成的。使用帶有氙燈光源和積分球的OL 770多通道分光輻射計(jì)獲取紫外可見光譜。吸光度的計(jì)算方法為：吸光度=1-（反射率+透射率）

05.橢圓偏振光譜法

使用橢圓偏振光譜儀進(jìn)行了橢圓偏振光譜測量。在與3DFG電極具有相同成分和形態(tài)但尺寸更大的樣品上進(jìn)行了光譜采集。在300至1700納米的波長范圍內(nèi)，以三個入射角測量了橢圓偏振角Ψ和Δ，并進(jìn)行擬合以獲得電極的介電函數(shù)。所用的擬合模型包括作為基底的500微米厚的玻璃層（二氧化硅）以及由兩個洛倫茲振蕩器構(gòu)成的1.5微米厚的3DFG材料層。3DFG層的厚度值對應(yīng)于通過橫截面掃描電子顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)測量的合成3DFG材料的平均厚度。3DFG層的介電函數(shù)通過一個振蕩器和兩個高斯振蕩器進(jìn)行建模。為了全面模擬介電函數(shù)實(shí)部的色散，添加了兩個極點(diǎn)振蕩器。這些振蕩器函數(shù)確保了所獲得的3DFG材料介電函數(shù)的實(shí)部和虛部滿足Kramers-Kronig關(guān)系。擬合過程很好地重現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終均方誤差非常低。

06.光電流測量

使用放大器進(jìn)行光電流測量。將3DFG MEA放置在倒置顯微鏡的載物臺上，以便將皮秒脈沖激光聚焦在電極上。3DFG MEA的培養(yǎng)孔中充滿PBS，鉑絲浸入PBS中作為電流測量的參比電極。放大器前置放大器連接到3DFG電極，在激光照射期間采集電壓鉗（V=0）的軌跡。

07.電化學(xué)表征

按照先前文獻(xiàn)中所述的方法，使用三電極電池裝置中的恒電位儀進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）實(shí)驗(yàn)。為了使微電極與電解質(zhì)接觸，使用聚二甲基硅氧烷將聚苯乙烯孔密封到MEA芯片上。鉑絲和銀/氯化銀電極分別用作對電極和參比電極。使用PBS作為電解質(zhì)溶液。在相對于銀/氯化銀電極的電位范圍為-1至1 V的條件下，以500 mV/s的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）測試。電流值根據(jù)微電極的幾何表面積進(jìn)行歸一化處理。陰極電荷存儲容量通過在循環(huán)伏安曲線中位于水電解窗口內(nèi)的電位范圍內(nèi)對陰極電流進(jìn)行時間積分來計(jì)算。電化學(xué)阻抗譜（EIS）在0.1至100，000 Hz的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行，直流電壓（VDC）為0 V，交流電壓（VAC）為10 mV。CV和EIS實(shí)驗(yàn)均在接地的法拉第籠內(nèi)進(jìn)行。對于每種幾何尺寸，對多個電極的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

08.生物相容性測試的樣品制備

將3DFG和對照基底置于24孔板中，用70%乙醇處理1小時進(jìn)行滅菌，然后在培養(yǎng)箱中進(jìn)行2小時的紫外線照射。滅菌后，芯片用1×PBS溶液沖洗三次，然后在室溫下用纖連蛋白處理3小時。孵育結(jié)束后，吸出多余的纖連蛋白，再用1×PBS溶液沖洗三次。接著，將細(xì)胞以一定的密度接種于培養(yǎng)基中。樣品在特定條件下培養(yǎng)10天，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)6天后，對細(xì)胞活力和細(xì)胞應(yīng)激進(jìn)行研究。

09.細(xì)胞存活率

細(xì)胞存活率的測試遵循了先前的方案。我們使用了Live/Dead檢測試劑盒，其中包含鈣黃綠素乙酰氧基甲酯和乙錠同聚體染料，分別用于對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色。使用Hoechst 33342染料對細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記。Hoechst、calcein AM和乙錠同聚體染料分別以1μg/mL、2μM和4μM的終濃度添加到每個樣品中，并在37°C和5%CO2條件下孵育30分鐘。然后，用10μM的某種物質(zhì)處理細(xì)胞，以解耦細(xì)胞的興奮和收縮，抑制細(xì)胞的自發(fā)跳動。用1×PBS沖洗細(xì)胞三次，然后在37°C下使用直立共聚焦顯微鏡在20×/0.50數(shù)值孔徑（NA）的水浸物鏡下進(jìn)行活細(xì)胞成像。在四個重復(fù)實(shí)驗(yàn)（測試樣品和對照樣品）中進(jìn)行量化，每個樣品采集五張圖像。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：

存活率=（活細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)）×100％。

10.細(xì)胞應(yīng)激

細(xì)胞應(yīng)激通過四甲基羅丹明乙酯檢測試劑盒進(jìn)行檢測。TMRE染料是一種可穿透細(xì)胞的陽離子紅橙色熒光染料，可被活躍的線粒體迅速攝取。將Hoechst和TMRE染料分別以1μg/mL和50 nM的終濃度加入每個樣本中，在37°C和5%CO2條件下孵育20分鐘。細(xì)胞用1×PBS洗滌三次，然后在37°C下使用正置共聚焦顯微鏡在40×/0.80 NA水浸物鏡下進(jìn)行活細(xì)胞成像。從四個重復(fù)樣本（測試樣本和對照樣本）中50至60個細(xì)胞的單通道（紅色）熒光圖像中量化熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用學(xué)生t檢驗(yàn)（雙側(cè)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

11.激光誘導(dǎo)細(xì)胞穿孔

細(xì)胞光穿孔裝置包括一臺正置顯微鏡和一臺1064納米激光器，脈沖寬度為8皮秒，重復(fù)周期為12.5納秒。在實(shí)驗(yàn)過程中，MEA采集系統(tǒng)被放置在顯微鏡的載物臺上，以便通過60×水浸物鏡（數(shù)值孔徑=1）將激光聚焦在3DFG電極上。一個程序負(fù)責(zé)采集電生理信號以及激光刺激。

12.hiPSC-CMs的培養(yǎng)

hiPSC衍生的心肌細(xì)胞Cor.4U和Pluricyte細(xì)胞購自某處。Cor.4U心肌細(xì)胞是心室、心房和結(jié)細(xì)胞的混合物，而Pluricyte細(xì)胞是心室心肌細(xì)胞。Cor.4U細(xì)胞先在涂有某種物質(zhì)的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，用某種鹽水去除死細(xì)胞，以獲得更好的檢測性能。之后，Cor.4U細(xì)胞用某種溶液分離，并在涂有某種溶液的3DFG-MEAs上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為特定溫度和二氧化碳濃度的濕熱培養(yǎng)箱。將Pluricyte細(xì)胞直接接種于涂有某種物質(zhì)的3DFG-MEAs上，在特定溫度、二氧化碳濃度的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3DFG-MEAs之前已通過紫外線照射進(jìn)行滅菌處理。兩種細(xì)胞系均以每MEA一定數(shù)量的細(xì)胞的密度接種。根據(jù)供應(yīng)商的建議，Cor.4U細(xì)胞在接種后特定天數(shù)進(jìn)行電生理記錄，Pluricyte細(xì)胞在接種后特定天數(shù)進(jìn)行電生理記錄。

13.人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞心肌細(xì)胞的免疫染色

在將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞心肌細(xì)胞接種于3DFG-MEAs上的第7天，使用人類心肌細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒對心肌肌鈣蛋白T和NKX2-5進(jìn)行免疫染色。細(xì)胞用某種物質(zhì)固定，然后在通透溶液中孵育。隨后，用某種物質(zhì)阻斷，然后在室溫下用稀釋的一抗在阻斷液中孵育。用洗滌緩沖液洗滌三次后，細(xì)胞在室溫下與稀釋的二抗在封閉液中孵育。最后，細(xì)胞用某種物質(zhì)復(fù)染，并在正置顯微鏡上用特定物鏡成像。

14.電生理記錄

電生理信號是通過一個定制的MEA采集系統(tǒng)獲取的，該系統(tǒng)基于Intan Technologies（洛杉磯，加利福尼亞州）的放大器芯片RHA2032。該系統(tǒng)提供24個采集通道，采樣率為10千赫茲，增益為200，電壓范圍為±5毫伏。關(guān)于該系統(tǒng)的更多細(xì)節(jié)可以在之前的工作中找到。信噪比（SNR）的計(jì)算方式為20×log10（Signal（V）/Noise（v）），其中噪聲計(jì)算為無信號時記錄軌跡的均方根值的6.6倍。