奶牛乳腺炎屬于奶牛的一種常見疾病，是制約奶牛健康養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。人畜共患的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。近年來抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用加劇了金黃色葡萄球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行，這給奶牛乳腺炎的預防治療增加了難度和成本，同時病原菌和抗生素對奶產(chǎn)品與環(huán)境的污染嚴重威脅了公共衛(wèi)生安全。研究金黃色葡萄球菌的耐藥機制和環(huán)境適應機制對指導抗生素在治療奶牛乳腺炎中的合理使用、遏制耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。本試驗利用基因編輯技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)、TEM、q RT-PCR和全基因組測序技術(shù)等，對奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌的耐藥相關(guān)基因進行了檢測和功能分析，并且對在本實驗中發(fā)現(xiàn)的一種新的細菌表型異質(zhì)亞群進行了表型檢測和表型異質(zhì)產(chǎn)生機制的探究，揭示了金黃色葡萄球菌耐藥相關(guān)基因與菌群表型異質(zhì)性對細菌群體抗生素耐藥性和環(huán)境適應能力的影響。

主要研究結(jié)果如下:

(1)奶牛乳腺炎源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐藥相關(guān)基因的檢測與分析。以奶牛乳腺炎來源的MRSA菌株BA01611為研究對象，參考實驗室前期的BA01611在苯唑西林抗生素處理下的RNA-seq數(shù)據(jù)，選擇了15個表達水平受抗生素影響且在金黃色葡萄球菌中缺乏研究的基因，構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒，最后成功獲得了9株BA01611基因敲除菌株。通過對這9株菌以及實驗室前期已構(gòu)建完成的7株BA01611基因敲除菌株進行抗生素耐藥性檢測，最終發(fā)現(xiàn)了13個與奶牛乳腺炎源MRSA抗生素耐藥性相關(guān)的基因，包括1個與抗生素抗性成負相關(guān)的基因和12個呈正相關(guān)的基因，其中有3個基因的敲除嚴重降低了BA01611菌株的抗生素耐藥性，它們分別為:屬于Lyt R-Cps A-Psr家族的編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因lcpA、屬于Lys R家族的編碼谷氨酸鹽合酶轉(zhuǎn)錄激活因子的基因glt C和屬于Mar R家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SAV0686。

(2)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因lcpA對不同金黃色葡萄球菌抗生素耐藥性和細胞黏附等生物學特性影響的研究，以及表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC的分離。本試驗構(gòu)建了金黃色葡萄球菌菌株Mu50和Newman的lcpA敲除菌株，并從Mu50的lcpA敲除菌株中分離出一種新的耐藥性增強且能形成大菌落的表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC。通過檢測細菌抗生素耐藥性發(fā)現(xiàn)lcpA對抗生素耐藥性的影響存在菌株特異性:敲除lcpA顯著降低了BA01611和Newman對大部分靶向細胞壁和核糖體抗生素的抗性;敲除lcpA不影響Mu50對多數(shù)靶向細胞壁抗生素的抗性，但降低了其對靶向核糖體抗生素的耐藥性;敲除lcpA增強了表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC對靶向細胞壁抗生素的耐藥性，但不影響其對靶向核糖體抗生素的耐藥性。此外，通過各項檢測試驗發(fā)現(xiàn)lcpA對金黃色葡萄球菌其它生物學特性也具有菌株特異性的影響:對于BA01611，敲除lcpA降低了黏附宿主細胞和菌體抗裂解能力，但增強了生物膜的形成和誘導宿主細胞炎癥因子表達的能力，而對其菌黃素合成和菌落擴散沒有顯著影響;對于Mu50，敲除lcpA對其黏附宿主細胞、菌體抗裂解、菌落擴散和生物膜形成影響不顯著，但能降低其菌黃素的合成，增強其誘導宿主細胞炎癥因子表達的能力。以上結(jié)果表明:lcpA對金黃色葡萄球菌耐藥性具有重要作用，但對Mu50具有菌株特異性影響，lcpA對細菌致病性的影響比較復雜;Mu50△lcpA菌株可以通過在細菌群體內(nèi)產(chǎn)生表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC來增強群體對抗生素的抵抗能力。

(3)金黃色葡萄球菌表型異質(zhì)菌株Mu50△lcpA-LC的表型檢測及其表型異質(zhì)產(chǎn)生機制的探究。利用TEM等方法對Mu50△lcpA-LC表型進行全面分析，結(jié)果顯示:Mu50△lcpA-LC的菌黃素合成水平降低、細胞體積增大，菌落擴散能力增強，生物膜形成能力減弱，在平板上形成表型可逆的淡黃色大菌落。通過與宿主細胞共孵育發(fā)現(xiàn)Mu50△lcpA-LC具有更強的宿主細胞黏附能力和刺激宿主細胞免疫因子表達的能力。利用q RT-PCR和全基因組測序等技術(shù)對細菌碳源代謝水平進行檢測和基因組序列比對分析，發(fā)現(xiàn)Mu50△lcpA-LC通過上調(diào)acs A等基因的表達水平加速細菌在對數(shù)期對乙酸鹽的代謝利用，從而下調(diào)cid等基因的表達，抑制對數(shù)期菌體細胞壁的水解和平臺期細胞的裂解，同時，Mu50△lcpA-LC三羧酸循環(huán)顯著增強，細菌蛋白表達和分泌模式發(fā)生顯著改變，此外，Mu50△lcpA-LC的編碼蛋白A的基因spa表達被激活，這可能幫助細菌逃避機體免疫。Mu50△lcpA-LC碳源代謝水平的變化可能與其表型異質(zhì)有關(guān)。Mu50△lcpA-LC表型異質(zhì)的發(fā)生可能與其碳源代謝水平發(fā)生變化有關(guān)。

以上結(jié)果表明:Mu50△lcpA可以不依賴基因序列的變化和環(huán)境改變，在群體內(nèi)部通過調(diào)控碳源代謝產(chǎn)生具有耐藥和高擴散能力等表型優(yōu)勢的表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC，從而增強細菌群體對環(huán)境的適應能力。綜上所述，本試驗在奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌中篩選出了13個的耐藥相關(guān)基因，全面分析了磷酸轉(zhuǎn)移酶基因lcpA在不同流行菌株中的功能差異，揭示了lcpA功能的菌株特異性。同時，本試驗在Mu50△lcpA菌株群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的耐藥表型異質(zhì)亞群Mu50△lcpA-LC，通過對表型異質(zhì)亞群的菌群擴散能力、抗生素耐藥性和細胞黏附等表型變化的詳細闡述，以及對其表型異質(zhì)產(chǎn)生機制的探究，揭示了菌群內(nèi)表型異質(zhì)性對金黃色葡萄球菌應對環(huán)境壓力的重要作用。本研究豐富了我們對金黃色葡萄球菌環(huán)境適應能力的認識，為后續(xù)MRSA耐藥性研究提供了材料資源和理論基礎(chǔ)，為治療由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)。