【摘要】：對于生物體的研究，大多是以細(xì)胞為基本單元為基礎(chǔ)展開的。人們對細(xì)胞的研究大多局限于細(xì)胞群體的分析，很難獲得單個細(xì)胞的信息。但是我們知道細(xì)胞之間存在個體差異性，群體分析使很多生物學(xué)研究受到限制，而單細(xì)胞分析能夠提供細(xì)胞個體差異性的相關(guān)信息，所以單細(xì)胞的研究顯得非常重要。在單細(xì)胞層面研究過氧化氫及膽固醇在細(xì)胞膜中的運(yùn)動具有重要的生物學(xué)意義。所以本文基于微電極電化學(xué)方法深入研究了單細(xì)胞內(nèi)過氧化氫含量及細(xì)胞膜中膽固醇的翻轉(zhuǎn)動力學(xué)。研究工作如下：

(1)微電極陣列已用于高通量的單細(xì)胞分析研究，然而將細(xì)胞培養(yǎng)在單細(xì)胞尺寸大小的微洞電極表面之后，再想通過在電極表面進(jìn)行功能化修飾來增加信號檢測的靈敏度將會有一定的難度。因此，論文第一部分研制了納米環(huán)狀電極來實(shí)現(xiàn)將電極表面和細(xì)胞支持面兩者分開這一目的；另外，我們還通過對電極表面進(jìn)行一些功能化修飾來提高單細(xì)胞分析的電化學(xué)靈敏度。通過電極的電化學(xué)性質(zhì)以及Comsol軟件模擬發(fā)現(xiàn)在納米電極表面，物質(zhì)的擴(kuò)散速度會加快，這有利于提高檢測信號。為了證實(shí)功能化修飾后的納米環(huán)狀電極能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞水平的分析，我們在納米環(huán)狀電極表面電鍍修飾一層普魯士藍(lán)，然后用來檢測單細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫含量。我們制備的功能化修飾后的納米環(huán)狀電極大大提高了電化學(xué)響應(yīng)，可以檢測到幾百皮安的電流值。經(jīng)過該功能化修飾過的納米環(huán)狀電極對于高通量單細(xì)胞電化學(xué)分析的發(fā)展起到了一定的促進(jìn)作用。

(2)膽固醇在細(xì)胞磷脂雙分子層膜中的運(yùn)動已有相關(guān)研究報道，然而傳統(tǒng)的研究大多采用膽固醇熒光類似物方法，對膽固醇熒光類似物進(jìn)行檢測，而并不是對膜膽固醇的直接檢測。對此，論文第二部分利用電化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)無熒光標(biāo)記分析檢測。我們使用具有兩個腔室的縮醛樹脂杯，在兩腔室間只有一個50微米大小的微洞是相通的；通過在微洞上使用二植酰磷脂酰膽堿構(gòu)建人工磷脂雙分子層膜。我們采用電化學(xué)方法對膽固醇在細(xì)胞膜上的時間動力學(xué)進(jìn)行探索研究；另外，還對微電極表面進(jìn)行膽固醇氧化酶修飾來提高電化學(xué)靈敏度。為了避免在電化學(xué)檢測中所施加的電壓影響人工脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，實(shí)驗中對膽固醇電化學(xué)信號檢測的最小電壓進(jìn)行了探究，目的是為了能夠檢測膽固醇的同時維持磷脂雙分子層膜的穩(wěn)定性。最終確定0.3 V作為膽固醇電化學(xué)檢測的電壓值。實(shí)驗結(jié)果表明，膽固醇在磷脂雙分子層膜中的翻轉(zhuǎn)時間平均為275s左右，即平均為4.6min左右。這是首次利用非熒光類似物的熒光標(biāo)記方法獲得膽固醇在磷脂雙分子層膜中的翻轉(zhuǎn)速度，為后期膽固醇在具有病理特征細(xì)胞細(xì)胞膜中的翻轉(zhuǎn)研究提供了技術(shù)手段。