研究簡介:微生物附著在惰性表面和生物表面上，很容易形成生物膜這在醫(yī)療環(huán)境中尤其成問題，因為干燥的表面生物膜可以在多種表面上存活很長一段時間。生物膜中的微生物群落對殺菌劑、抗生素和物理壓力不太敏感因此，干燥的表面生物膜可以在衛(wèi)生保健相關(guān)感染的傳播中發(fā)揮重要作用，而干燥的環(huán)境表面是病原體轉(zhuǎn)移的持續(xù)來源。銅和銅合金表面近年來受到越來越多的關(guān)注，作為一種減少細菌附著和生物膜以及隨后在醫(yī)療機構(gòu)中病原微生物傳播的方法，從而有可能減輕醫(yī)院介導(dǎo)感染的發(fā)生。在干燥的銅表面上，細菌是通過接觸介導(dǎo)的殺滅過程被殺滅的銅從表面溶解并積累在金屬基質(zhì)和細菌細胞之間的水界面，導(dǎo)致嚴重的膜損傷和細胞質(zhì)中的銅離子過載。考慮到銅銀合金是一種電化學(xué)活性表面，并且預(yù)期與其他銅合金表面有不同的行為，這種合金的抗菌效果可能會在這種干燥的情況下得到增強表面接觸是銅合金表面公認的主要殺傷因素，殺傷率對任何實際應(yīng)用都至關(guān)重要。此外有證據(jù)表明，在表面接觸建立后，殺滅過程立即啟動，銅離子的暴露表面積和釋放速率容易影響接觸殺滅的總體速率。因此本研究的目的是確定銅銀合金涂層在更接近真實條件下的抗菌活性，例如，在允許細菌生物膜形成的干燥條件下。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

pH測量采用pH微電極(PH25，針尖直徑≈25μm,Unisense A/S)，pH值在pH 4~9之間呈線性變化，90%響應(yīng)時間<10 S。pH微電極與參比微電極(REF-100，端徑≈100μm;Unisense A/S)浸入瓊脂糖基質(zhì)，以確保與微電極的電接觸。pH微電極根據(jù)三個pH緩沖液(pH 4.01,7.00和10.01，在實驗溫度下)的傳感器讀數(shù)進行校準，在校準范圍內(nèi)與pH值線性響應(yīng)。pH微電極連接到萬用表(Unisense a/S)，在PC運行軟件(SensorTrace Suite;Unisense/S)。在操作過程中，微電極傳感器被安裝在一個pc接口的電動微操作器(MM33-2,MC-232）上定位。將接種的凝膠基體放置在銅銀合金涂層或未涂層的AISI 316基板載體(25×75 mm)上，并將電極小心地放置在與金屬表面的安全距離(<100μm)處，速度越快越好。為了捕捉初始pH上升，傳感器被放置在靠近表面(<100μm)，0.5%低熔點瓊脂糖(超純LMP瓊脂糖，Invitrogen，美國)沉積在傳感器和參考電極尖端的表面。

實驗結(jié)果

研究了銅銀合金涂層在干燥和現(xiàn)實生活條件下對細菌污染的抗菌性能。使用美國環(huán)保局的測試方法作為消毒劑和持續(xù)減少細菌污染的效果，并通過CLSM直接可視化。該合金成功通過了EPA兩種測試方法的驗收標準，在接觸2小時后，還原百分比等于或大于99.9%，在24小時時間間隔內(nèi)，還原百分比大于99.9%。在銅銀合金涂層和非涂層表面接觸殺滅的現(xiàn)場監(jiān)測中，我們發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌8325對細菌生物膜的殺滅率高于銅綠假單胞菌PAO1。對銅銀合金涂層表面的pH測量和監(jiān)測顯示，當(dāng)金黃色葡萄球菌8325懸浮液存在于表面和瓊脂糖鹽基質(zhì)之間的界面時，20分鐘后pH值迅速增加，并在pH 9.0時達到平臺期。

圖1、銅綠假單胞菌PAO1活細胞和死細胞暴露于a-d)銅銀合金涂層和e-h)未涂層AISI 316表面在a開始時監(jiān)測，e)暴露后，b,f)10分鐘，c,g)25分鐘和d,h)60分鐘。箭頭表示金屬表面的位置。細胞用改良活/死染料染色混合物(0.2%SYTO 9綠色熒光核酸和0.2%SYTOX AADvanced死細胞染色)染色，活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。

圖2、銅綠假單胞菌PAO1活細胞和死細胞暴露于a-d)銅銀合金涂層和e-h)未涂層AISI 316表面在a開始時監(jiān)測，e)暴露后，b,f)10分鐘，c,g)25分鐘和d,h)60分鐘。箭頭表示金屬表面的位置。細胞用改良活/死染料染色混合物(0.2%SYTO 9綠色熒光核酸和0.2%SYTOX AADvanced死細胞染色)染色，活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。

圖3、金黃色葡萄球菌8325活細胞和死細胞的比例a)銅銀合金涂層和b)未涂層AISI 316表面和銅綠假單胞菌PAO1活細胞和死細胞暴露于c)銅銀合金涂層和d)未涂層AISI 316表面。

圖4、用0.15 m NaCl 0.5%瓊脂糖基質(zhì)加載金黃色葡萄球菌8325懸浮液對鍍銅銀合金和未涂覆SS316表面的pH值進行監(jiān)測。*由于傳感器定位較慢，該復(fù)制用模型(在實驗部分表明)進行了擬合，該模型允許外推其初始pH上升。

圖5、在未加載0.15 m NaCl 0.5%瓊脂糖基質(zhì)下，銅銀合金涂層和未涂層SS316表面的pH監(jiān)測。

結(jié)論與展望

本研究設(shè)計了一種定制的共聚焦成像協(xié)議，可以實時可視化銅銀合金表面細菌生物膜的殺死過程，并監(jiān)測100分鐘的動力學(xué)。銅銀合金涂層在5分鐘內(nèi)根除革蘭氏陽性細菌的生物膜，而革蘭氏陰性細菌的生物膜則被殺死得更慢。原位pH監(jiān)測（unisense微電極剖面分析系統(tǒng)）表明，在金屬表面和細菌生物膜之間的界面增加了2 log單位;然而，當(dāng)在緩沖液中測試時，細菌的活力不受這個提高(pH 8.0-9.5)的直接影響。OH?的產(chǎn)生是電化學(xué)活性表面與細菌生物膜在環(huán)境條件下相互作用的結(jié)果，因此是銅銀合金涂層接觸介導(dǎo)殺滅的一個方面，而不是觀察到的抗菌效果的直接原因。細菌細胞的氧化、銅離子的釋放和局部pH值的提高共同決定了銅銀合金涂層干表面的抗菌活性。